色情 动漫 各神经元的 Marker 染色攻略，请收下

发布日期：2024-08-29 09:37    点击次数：158

纲领： 本文追念了各神经元 Marker 的特质及染色经过中的重点及防止事项。提及神经元，脑海里有莫得出现闪电的场景？   乌云下的那说念瞬息即逝的闪电看上去与神经元形似，没错！是形似而神不同。从皮囊上看似很像，但灵魂却绝对不同。神经元是神经系统的结构与功能单元之一。它占了神经系统约 10%， 由树突、轴突、髓鞘、细胞核组成（图 1）。神经元具有感受刺激和传导抖擞的功能。树突多呈树状分支，它可摄取刺激并将冲动传向胞体；轴突呈细索状，结尾常有分支，称轴突最后，轴突将冲动从胞体传向最后。频频一个神经元有一个至多个树突，但轴突唯唯一条。 神经元一方面摄取来自其它特定细胞的信息输入，另一方面其细长的轴突又会定向投射到靶细胞。他们的聚拢模式又会随脑的不同功能变化出现调整，共同完成脑的多样高等提示。神经元是一种高度分化的细胞，训练的神经元主要开头于神经干细胞的分化，神经干细胞在脑源性神盘算养因子、神盘算养素勾引因子的刺激下进一步分化成神经元前体细胞，最终又分化成神经元。这也曾过也不错通过转基因的递次，如在干细胞中转染相应的转录因子 Sox2 、Wnt、Nkx2.1 可分化出相应的神经元。最常见的训练神经元 Marker 是β3-Tubulin、Neurofilament、 NeuroN 。β3-Tubulin 和 Neurofilament 分辩属于细胞骨架的微管卵白和中间丝卵白，NeuroN 属于神经元细胞核卵白。下图是各训练神经元 Marker 染色完满（图 2）。 看了上头的图，有莫得咋舌「怎样不错染出这样逆天的好意思图？」「怎样作念到的?」掌抓了以下几点，就不难了！ 真切了解并细目要染色的神经元 找到针对样本可作念染色的抗体 制备极新高质地的样本 参考抗体公司给出的染色要领 首先，需要咱们细目染哪个神经元 Marker，唯独对需要染色的 Marker 有一个真切的意志色情 动漫，才知说念 Marker 的形态和定位。分析染色完满时才知说念真阳性是什么。因此色情 动漫，待染色的神经元 Marker 的特征要了解透顶。除了上文提到的最常用的β3-Tubulin、Neurofilament、 NeuroN，这里，我追念了未训练和训练神经元 Marker 的特征，干货大放送，详见表 1、2。表 1：未训练神经元   神经元 Marker 布景先容 Doublecortin 双皮质素是与微管干系的卵白，可判辨微管并使其成束。保守的双皮质素结构域介导与微管相互作用，而况，真理的是，大部分错义突变簇集在这个结构域中。激酶 JNK、CDK5 和 PKA  磷酸化双皮质素。JNK 磷酸化 Thr321、Thr331 和 Ser334， 而 PKA 磷酸化 Ser47 而况 CDK5 磷酸化 Ser297。Ser297 磷酸化的双皮质素对微管的亲和力镌汰。另外， Ser297 的突变会导致迁徙流毒。双皮质素的突变形成无脑回症（光滑脑），这是一种以癫痫和精神发育迂缓为特征的神经元迁徙荒谬症状。 TBR1 T 盒脑卵白 1 (TBR1)  是脊椎动物胚胎发育经过中的一个紧迫转录因子。手脚 T 盒转录因子家眷的一员，TBR1  在有丝分裂后期谷氨酸能投射神经元中抒发。在皮质神经发生经过中，转录因子 Pax6、TBR2 和  TBR1 的礼貌抒发会革新投射神经元分化中的分离要领。TBR1 在发育皮质的层 6 富集。在 TBR1 缺失的情况下，TBR1 突变体在前脑皮层和层 6 分化方面存在严重流毒，标明 TBR1 可调控有丝分裂后期皮质神经元的区域和分层脱色性。因此，TBR1  抒发可用作有丝分裂后期谷氨酸能神经元和皮质分层特异性的一个象征。 NeuroD NeuroD 是碱性螺旋 - 环 - 螺旋 (bHLH)  转录因子家眷的一员。这些卵白与 E 卵白共同形成异二聚体，可谀媚典型的 E 盒序列 CANNTG。神经元活性会引起  CaMKII 介导 NeuroD 在 Ser336 位点的磷酸化，这是树突形成和滋长所必需的。NeuroD  还在 Ser274 位点被磷酸化，其完满字据具体情况而不同，因为 Erk 磷酸化会刺激胰腺 β 细胞中的 NeuroD 活性，而 GSK-3β  磷酸化则会阻拦神经元中的 NeuroD。NeuroD 对胰腺和发育性神经系统至关紧迫，在内耳和哺乳动物视网膜的发育经过中起着很大的作用。枯竭  NeuroD 的小鼠会患严重的糖尿病，而况可能会在降生后不久因 β 细胞分化流毒而牺牲。脑细胞内枯竭 NeuroD 会导致严重的发育流毒。东说念主基因突变与  I 型糖尿病和年青成年发病的糖尿病等多种类型的糖尿病谋划。 表 2：训练神经元   神经元 Marker 布景先容 β3-Tubulin 细胞骨架由三种类型的细胞质基质纤维组成：微管、微丝（肌动卵白纤丝）和中间纤丝。球形微管卵白亚基包含微管开拓块，由  α/β-tubulin 异源二聚体形成统共真核细胞的 tubulin 亚基。需要 γ-tubulin  使微管卵白亚基团员成核，从而形成微管团员物。好多细胞判辨是通过微管能源介导的，包括纤毛和鞭毛舞动、膜囊泡的核质转运、在减数分裂 / 有丝分裂时刻染色体对皆和神经轴突迁徙。这些判辨是由于竞争性微管团员作用妥协聚作用或通过微管能源卵白的判辨产生的。    β3-tubulin (TUBB3) 是六个 β-tubulin  同工型之一，在胎儿发育和产后发育（轴突导向和训练）中高度抒发。其抒发水平在成东说念主核心神经系统 (CNS) 中镌汰，但在周围神经系统 (PNS)  中保持高水平抒发。在 β3-tubulin 中富集的微管比由其他 β-tubulin 同工型组成的微管更有活力。征询标明，β3-tubulin 基因  TUBB3 的突变，会导致动眼流毒和其他神经系统疾病。另外，β3-tubulin 在肿瘤细胞中出现，但不在正常分化的胶质细胞中出现。因此，β3-tubulin 是一个主要的神经元象征物。 NeuN 神经元细胞核  (NeuN， Fox-3， RBFOX3) 是一种在无数核心和周围神经系统的有丝分裂后神经元中抒发的胞核卵白。NeuN 在浦肯野细胞、交感神经节细胞、Cajal-Retzius 细胞、INL  视网膜细胞、下橄榄核或齿胞核神经元中均未检测到。这种神经元蛋鹤发先是使用一种称为 NeuN 的单克隆抗体通过免疫细胞化学响应被矍铄。通过 MS  分析，NeuN 被矍铄为 Fox-3 基因产物。Fox-3 包含一个 RNA 识别基序，并手脚一种剪切革新分子进展作用 。Fox-3 革新 NumB  的选拔性剪切，进而促进发育经过中的神经元分化 。 Neurofilament 细胞骨架包含 3  种类型的细胞溶质纤维：肌动卵白微丝、中间纤丝和微管。神经丝是神经元的主要中间纤丝，包括轻 (NFL) 亚基、中  (NFM) 亚基和重 (NFH) 亚基。与其它中间纤丝卵白的结构雷同，神经丝也具有一个球状的氨基结尾头、一个中央  α- 螺旋杆结构域和一个羧基结尾尾区。它的前体纤维由一种异型四聚体单元（NFL-NFM 和 NFL-NFH）组成，八条这样的前体纤维组成一个典型的 10  nm 的中间纤丝。神经丝在轴突径向滋长和轴突口径中进展作用，微管参与轴突伸长。PKA 磷酸化 NFL 和 NFM 的头端结构域，并阻拦神经丝的采集。征询标明，神经丝的采集在好多东说念主神经系统疾病中被发现，包括帕金森病（与 Lewy 小体中  α- 突触核卵白谋划）、阿尔茨海默病、腓骨肌萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS)。 MAP2 微管谀媚卵白 2  (MAP2) 是一种神经元磷卵白，可革新微管的结构和判辨性、神经元形态形成、细胞骨架能源学以及轴突和树突细胞中的细胞器转运。神经元中有多种 MAP2 同工型抒发，包括高分子量 MAP2A 和 MAP2B（280 和 270 kda）和低分子量  MAP2C 和 MAP2D（70 和 75 kda。MAP2 磷酸化可革新与细胞骨架的谀媚，而况受发育调控。GSK-3 和 p44/42 MAP 激酶在  Ser136、Thr1620 和 Thr1623 位点磷酸化 MAP2。GSK-3 在 Thr1620/1623 的磷酸化会阻拦 MAP2  与微管的谀媚以及微管判辨性。 UCHL1  卵白泛素化和去泛素化是由泛素化酶 (UBE) 和去泛素化酶  (DUB) 催化的可逆经过。DUB 分为 5 个亚家眷：USP、UCH、OTU、MJD 和  JAMM。UCHL1、UCHL3、UCHL5/UCH37 和 BRCA-1 谀媚卵白 - 1 (BAP1) 属于 DUB 的泛素羧基结尾水解酶 (UCH)  家眷，它们均包含一个大致由 230 个氨基酸组成的保守催化 UCH 结构域。UCHL5 和 BAP1 具有特有的羧基结尾延长尾区。UCHL1 在神经元组织和睾丸中高度抒发，而 UCHL3  抒发分散则愈加闲居。尽管 UCHL1 和 UCHL3 是最轮廓干系的 UCH 家眷成员，具有大致 53% 的同样性，但它们的生化本性却不同， UCHL1  谀媚单泛素，而 UCHL3 则对泛素 (Ub) 和泛素样分子 NEDD8 具有双重特异性。    UCHL1 (PGP 9.5/PARK5) 可手脚去泛素化酶和单泛素判辨剂进展作用。体外征询讲授，UCHL1 大致水解泛素羧基结尾甘氨酸和靶标卵白赖氨酸  ε- 氨基组之间的异肽键。UCHL1 还参与促泛素和核糖体卵白的共翻译加工经过，二者被翻译手脚泛素和会卵白。 枯竭 UCHL1 的小鼠会出现痉挛，标明  UCHL1 活性是正常神经肌肉接合结构和功能所必需的。征询标明，UCHL1  在多种东说念主恶性肿瘤中的抒发缺失，如前线腺癌、结直肠癌、肾癌和乳腺癌。征询东说念主员发现，UCHL1 在乳腺癌中抒发缺失是由 UCHL1  基因初始子的超甲基化所致。UCHL1 抒发缺失与东说念主肿瘤发生谋划，而 UCHL1 突变则与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病谋划。 Enolase-2 Enolase 是参与  2 - 磷酸甘油酸盐转换成磷酸烯醇丙|酮酸盐的糖酵解酶。哺乳动物的 enolase 有三个亚基：α、β 和 γ，不错形成同型二聚体和异二聚体。γ  enolase 的同型二聚体具有神经元特异性。征询已裸露，神经元特异性的 enolase-2 在成神经细胞瘤 和小细胞肺癌中的水平有所擢升。 Tau Tau  是一种异源微管干系卵白，可促进并判辨微管拼装，尤其是在轴突中。现已发现 6  种同工型，它们有不同的氨基结尾插入点，而况在羧基结尾周围有不同数目的串联叠加序列，tau 在大致 25 个位点被 Erk、GSK-3 和 CDK5  高度磷酸化。磷酸化会削弱 tau 谀媚微管的才能。神经元纤维缠结是阿尔茨海默病的一个主要标记；这些缠结是由高度磷酸化的  tau 组成的成对螺旋纤丝束。尤其是，GSK-3 或 CDK5 磷酸化 Ser396  会使微管变得不判辨。此外，征询标明，在好多其它神经退行性疾病细胞中会发现 tau 内含物，统称  tau 病变。 Thy1/CD90  Thy1/CD90  细胞名义抗原是一种 GPI 锚定、受发育调控的卵白，它参与能介导神经突增生、T 细胞激活、肿瘤阻拦、凋一火及纤维化的信号转导级联。Thy1/CD90  在成体神经元名义高抒发，被以为在革新黏附与迁徙活动（如神经突延长）的经过中起作用。Thy1/CD90  mRNA 和卵白抒发下落与上皮性卵巢癌的发生谋划联，标明可能具有潜在的东说念主卵巢癌抑癌基因作用。征询标明，Thy1/CD90  敲除小鼠会出现皮肤免疫应付受损，及视网膜发育荒谬。Thy1/CD90 在某些疾病情状（如肺纤维化）受表不雅遗传革新，或出现失调。Thy1/CD90  初始子的潜在可逆过度甲基化可能会为这种疾病提供新的诊疗选拔。 其次，需要找寻可靠的抗体。一支抗体，不错作念 WB， 不一定不错作念免疫荧光；不错作念细胞的免疫荧光，不一定不错作念组织的免疫荧光。对于抗体的这一本性，不错绝对参考抗体默契书。在 CST 的官网及居品默契书上，写有 IF-IC 的暗示不错作念细胞的免疫荧光；写有 IF-F 的暗示不错作念冰冻切片的免疫荧光。若是抗体的诳骗栏莫得写 IF， 则暗示该抗体弗成作念 IF 或者作念 IF 的后果不好，请严慎选拔！小编已经帮您列好不错作念神经元染色的抗体，请参考下表。   神经元 Marker 居品编号 居品称呼 诳骗 响应性 Doublecortin  #14802 Doublecortin (A8L1U) Rabbit mAb IF-F M TBR1 #49661 TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb IHC-P H M R #45664 TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) IF-F M #66626 TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 594 Conjugate) IF-F M #32518 TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) IF-F M NeuroD #4373 NeuroD (D35G2) Rabbit mAb WB，IP，ChIP H， M， R #7019 NeuroD (D90G12) Rabbit mAb WB，IP H #2833 NeuroD Antibody WB，IP H MAP2 #8707 MAP2 (D5G1) XP® Rabbit mAb WB，IP，IF-F M， R #4542 MAP2 Antibody WB，IF-F H， M， R， Mk #4541 Phospho-MAP2 (Ser136) Antibody WB，IF-F H， R， Mk #4544 Phospho-MAP2 (Thr1620/1623) Antibody WB，IF-F H NeuN #24307 NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAb WB，IHC，IF-F H， M， R #54761 NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) IF-F H， M， R #12943 NeuN (D3S3I) Rabbit mAb WB，IF-F H， M， R Neurofilament-M #2838 Neurofilament-M (RMO 14.9) Mouse mAb WB，IP，IHC，IF-F H， M， R #2835 Neurofilament-L (DA2) Mouse mAb WB，IHC，IF-F H， M， R #2837 Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb WB，IHC，IF-F H， M， R #2836 Neurofilament-H (RMdO 20) Mouse mAb WB，IHC，IF-F H， M， R #8024 Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) IF-F H， M， R #8743 Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 594 Conjugate) IF-F H， M， R #1005 Neurofilament-L Blocking Peptide     #9781 Neurofilament Antibody Sampler Kit     Enolase-2 #8171 Enolase-2 (D20H2) Rabbit mAb WB，IP H， M， R， Mk #9536 Enolase-2 Antibody WB H，M Tau #46687 Tau (D1M9X) XP® Rabbit mAb WB，IHC，IF-F，IF-IC H， M， R #4019 Tau (Tau46) Mouse mAb WB，IF-F，IF-P H， M， R #49561 Phospho-Tau (Thr205) (E7D3E) Rabbit mAb WB，IP，IF-F，IF-P H， M， R #20194 Phospho-Tau (Ser404) (D2Z4G) Rabbit mAb (IF preferred) WB，IP，IF-F，IHC H， M， R #12885 Phospho-Tau (Thr181) (D9F4G) Rabbit mAb WB，IP，IHC-P H， M， R #15013 Phospho-Tau (Ser416) (D7U2P) Rabbit mAb WB，IP，IHC-P H， M， R #77348 Phospho-Tau (Ser214) (D1Q2X) Rabbit mAb WB，IP H， M， R #35834 Phospho-Tau (Ser404) (D2Z4G) Rabbit mAb (IHC preferred) WB，IHC-P H， M， R #29957 Phospho-Tau (Ser199) Antibody WB H， M， R #39357 Phospho-Tau (Ser202) (D4H7E) Rabbit mAb WB H， M， R #9632 Phospho-Tau (Ser396) (PHF13) Mouse mAb WB M， R #57519 FastScan™ Total Tau ELISA Kit   H， M， R #90554 FastScan™ Phospho-Tau (Ser416) ELISA Kit   H， M， R #96628 Phospho-Tau Family Antibody Sampler Kit     #56285 PhosphoPlus® Tau (Ser396) Antibody Duet     #82577 PhosphoPlus® Tau (Ser404) Antibody Duet     #14511 PhosphoPlus® Tau (Thr181) Antibody Duet     Thy1/CD90  #13801 Thy1/CD90 (D3V8A) Rabbit mAb WB ，IHC-P H， M， R UCHL1  #13179 UCHL1 (D3T2E) XP® Rabbit mAb WB，IHC-P，IF-IC H， M， R， Mk #11896 UCHL1 (D8R2I) XP® Rabbit mAb WB，IF-IC H， M， R， Mk #96956 UCHL1 (D3T2E) XP® Rabbit mAb (Biotinylated) WB H， M， R， Mk #3524 UCHL1 Antibody WB H， M， R， Mk #12415 SignalSilence® UCHL1 siRNA II   H #12353 SignalSilence® UCHL1 siRNA I   H β3-Tubulin #5666 β3-Tubulin (D65A4) XP® Rabbit mAb WB，IP，IHC-P H， M， R #5568 β3-Tubulin (D71G9) XP® Rabbit mAb WB，IF H， M， R #4466 β3-Tubulin (TU-20) Mouse mAb WB，IHC，IF-F， H， M， R 第三，要制备高质地的样本：1）对于细胞 培养细胞的代数年青 细胞莫得任何稠浊 细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上平直培养 细胞的密度一般在 60%-70% 2）对未固定的冰冻切片 保持组织的极新度 选拔符合的固定试剂和固定时辰 3）对于已经固定的冰冻切片 固定时，组织最佳是极新出炉的 第四，请参考抗体公司给出的践诺要领。因为 CST 的抗体都是里面严格交叉考据的，每一支抗体的荧光图片（等于上头那些亮盲眼的图片），都是按照优化的 protocol 作念出的。针对每一不错作念 IF 的抗体，样本该遴选什么样的固定试剂，固定时辰，封锁试剂及抗体稀释液和稀释比例等，CST 都逐一考据好，践诺者严格遵从就好。践诺要领那里找呢？先绽开 www.cst-c.com.cn， 输入相应的抗体货号，以#46687 为例，如下图，点击 IF， 然后张开「践诺要领」，就不错按要领操作了。     夫妻性爱技巧